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磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。

磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。

• 组织样品：按照质量(g)∶提取液体积(mL)＝1∶5～10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。
  
• 细胞样品：按照细胞数量(10⁴个)∶提取液体积(mL)＝500～1000∶1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。
  
• 血清样品：直接测定。

• 正式测定之前选择2～3个预期差异大的样本做预测定。
  
• 显色完成后，若有沉淀，于8000g，25℃离心5min后取上清测定。
  
• 吸光值不宜超过1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。

• 按下表加入相应成分配制反应体系：
  

  成分	空白管	标准管	测定管
  试剂一	100
  试剂二	150	150	150
  标准品		100
  样品			100
  试剂三	50	50	50

• 充分混匀，30℃反应30min，沸水浴10min。
  
• 打开盖子，自然冷却5min。
  
• 向各反应管中加入700μL试剂四。
  
• 30℃反应30min。
  
• 于1mL玻璃比色皿，空白管调零，测定500nm处吸光值，分别记为A标准管和A测定管。

• 按照蛋白浓度计算：
  酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
  

  PLD活性(nmol/min/mg prot)＝	A测定管	×C标准÷Cpr÷T＝16.7×	A测定管	÷Cpr
  	A标准管		A标准管

  
  
• 按照样本质量计算：
  酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
  

  PLD活性(nmol/min/g鲜重)＝	A测定管	×C标准÷W÷T＝16.7×	A测定管	÷W
  	A标准管		A标准管

  
  
• 按照细胞数量计算：
  酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
  

  PLD活性(nmol/min/104 cells)＝	A测定管	×C标准÷细胞数量÷T＝16.7×	A测定管	÷细胞数量
  	A标准管		A标准管

  
  
• 按照液体体积计算：
  酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
  

  PLD活性(nmol/min/mL)＝	A测定管	×C标准÷T＝16.7×	A测定管
  	A标准管		A标准管

• C_标准：标准品浓度，500nmol/mL；
  
• Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；
  
• W：样本质量，g/mL；
  
• T：反应时间，30min。